基因編輯技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域的核心技術(shù)之一，正以前所未有的速度推動著生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、生物制藥等多個領(lǐng)域的變革與發(fā)展，其中 CRISPR-Cas9 技術(shù)的出現(xiàn)更是使基因編輯的精準性、效率和應(yīng)用范圍得到了極大提升，宛如一把 “神奇的手術(shù)刀”，為攻克遺傳性疾病、培育優(yōu)良農(nóng)作物品種、開發(fā)創(chuàng)新藥物等提供了革命性的解決方案。

一、基因編輯技術(shù)行業(yè)概述?

1、定義?

根據(jù)北京研精畢智信息咨詢發(fā)布的調(diào)研報告指出，基因編輯又被稱作基因組編輯，是一項能夠?qū)ι矬w基因組特定目標基因進行精確修飾的技術(shù)。其核心原理是借助核酸內(nèi)切酶，精準識別并切斷目標 DNA 序列，造成 DNA 雙鏈斷裂（DSBs）。當 DNA 雙鏈斷裂發(fā)生后，生物體自身會啟動兩種主要的修復(fù)機制：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR） 。?

非同源末端連接修復(fù)途徑在沒有修復(fù)模板基因的情況下被觸發(fā)，此過程中，斷裂的 DNA 末端會直接連接，然而這種連接方式往往不夠精確，大概率會產(chǎn)生插入或缺失突變，導(dǎo)致整個基因發(fā)生移碼突變，進而使基因失去原有的功能，基于此原理的基因編輯技術(shù)通常被用于基因敲除，即通過破壞特定基因的功能，研究其在生物體內(nèi)的作用，或者用于治療某些由基因功能異常導(dǎo)致的疾病。?

同源重組修復(fù)途徑則需要有與目的 DNA 兩側(cè)同源的供體 DNA 模板（雙鏈質(zhì)?；蚴菃捂?DNA）存在時才會啟用。在這一過程中，生物體按照供體 DNA 模板來修復(fù)目的基因序列，能夠?qū)⒀芯空哳A(yù)先設(shè)計的供體基因精確插入到目標位點，實現(xiàn)對基因的定向改造，這種基因編輯技術(shù)被稱為基因敲入。基因敲入技術(shù)在基因治療中具有重要應(yīng)用，例如可以將正常的基因片段敲入到患者體內(nèi)的特定基因位點，以替代有缺陷的基因，從而治療某些遺傳性疾病；在生物制藥領(lǐng)域，也可通過基因敲入技術(shù)改造微生物，使其能夠高效生產(chǎn)特定的蛋白質(zhì)藥物。通過對這兩種修復(fù)機制的巧妙利用，基因編輯技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對 DNA 序列的刪除、插入、替換等多種遺傳改造操作，為生命科學(xué)研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用開辟了廣闊的前景。無論是在探索基因功能、研發(fā)新型藥物，還是在治療疑難病癥等方面，基因編輯技術(shù)都展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用價值，成為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。?

2、主要技術(shù)介紹?

根據(jù)市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，自基因編輯技術(shù)誕生以來，經(jīng)過不斷的發(fā)展和創(chuàng)新，已經(jīng)涌現(xiàn)出多種各具特色的技術(shù)方法，其中鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)、CRISPR/Cas 技術(shù)以及 RNA 編輯技術(shù)等在基因編輯領(lǐng)域占據(jù)了重要地位，它們各自具有獨特的作用機制、優(yōu)勢和應(yīng)用場景，推動著基因編輯技術(shù)在不同領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和深入發(fā)展。?

1.2.1 ZFN 技術(shù)?

鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)是第一代人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，其核心在于利用鋅指蛋白來實現(xiàn)對特定 DNA 序列的精準識別。鋅指蛋白是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中包含多個鋅指結(jié)構(gòu)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)域通常由約 30 個氨基酸組成，能夠特異性地識別并結(jié)合 DNA 上的 3 個連續(xù)堿基對。通過合理設(shè)計和組合不同的鋅指結(jié)構(gòu)域，可以構(gòu)建出能夠識別任意特定 DNA 序列的鋅指蛋白。?

將鋅指蛋白與核酸酶 FokI 進行融合，形成具有切割活性的鋅指核酸酶。當鋅指蛋白識別并結(jié)合到目標 DNA 序列后，與之融合的 FokI 核酸酶會被招募到該位點。FokI 核酸酶需要形成二聚體才能發(fā)揮切割活性，只有當兩個 ZFN 分子分別結(jié)合到目標 DNA 序列上相鄰的位點時，F(xiàn)okI 核酸酶才能形成二聚體，進而對 DNA 雙鏈進行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂。?

ZFN 技術(shù)的顯著優(yōu)點是具有較高的特異性，能夠相對精準地定位到目標 DNA 序列并進行編輯，這使得它在基因治療和基因功能研究等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價值。例如，在基因治療中，ZFN 技術(shù)可以用于糾正某些致病基因的突變，為一些遺傳性疾病的治療提供了新的途徑；在基因功能研究中，科研人員可以利用 ZFN 技術(shù)敲除特定基因，觀察生物體的表型變化，從而深入了解基因的功能。?

然而，ZFN 技術(shù)也存在一些明顯的局限性。首先，其設(shè)計和構(gòu)建過程極為復(fù)雜，需要對鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有深入的了解，并且需要耗費大量的時間和精力來篩選和優(yōu)化能夠特異性識別目標序列的鋅指蛋白組合。其次，ZFN 技術(shù)的成本較高，這在一定程度上限制了其大規(guī)模的應(yīng)用和推廣。此外，由于 ZFN 技術(shù)可能會引發(fā)細胞的免疫反應(yīng)，對細胞造成損傷，這也增加了其在實際應(yīng)用中的風險和不確定性。?

1.2.2 TALEN 技術(shù)?

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)是第二代基因編輯技術(shù)，其原理基于植物病原體黃單胞菌分泌的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子（TALE）。TALE 蛋白具有獨特的結(jié)構(gòu)，其中心重復(fù)區(qū)域由一系列高度保守的重復(fù)單元組成，每個重復(fù)單元通常包含 33 - 35 個氨基酸。這些重復(fù)單元的氨基酸序列存在微小差異，正是這些差異決定了 TALE 蛋白對不同 DNA 堿基的特異性識別能力。?

每個 TALE 重復(fù)單元能夠特異性地識別并結(jié)合 DNA 上的一個堿基，通過將不同的 TALE 重復(fù)單元進行有序排列，可以構(gòu)建出能夠識別任意特定 DNA 序列的 TALE 蛋白。將 TALE 蛋白與核酸酶 FokI 進行融合，形成 TALEN 分子。當 TALE 蛋白識別并結(jié)合到目標 DNA 序列后，F(xiàn)okI 核酸酶會被招募到該位點。同樣，F(xiàn)okI 核酸酶需要形成二聚體才能發(fā)揮切割活性，只有當兩個 TALEN 分子分別結(jié)合到目標 DNA 序列上相鄰的位點時，F(xiàn)okI 核酸酶才能形成二聚體，進而對 DNA 雙鏈進行切割，實現(xiàn)對目標基因的編輯。?

TALEN 技術(shù)相較于 ZFN 技術(shù)具有一些明顯的優(yōu)勢。首先，TALEN 的設(shè)計相對簡單，其識別 DNA 序列的機制更加直接和易于理解，科研人員可以根據(jù)目標 DNA 序列較為方便地設(shè)計和構(gòu)建相應(yīng)的 TALEN 分子，大大縮短了研發(fā)周期。其次，TALEN 技術(shù)具有更高的特異性，能夠更準確地定位到目標基因序列，減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生，這在基因治療和基因功能研究等對準確性要求極高的領(lǐng)域具有重要意義。例如，在基因治療中，TALEN 技術(shù)可以更精準地修復(fù)致病基因的突變，降低對正?；虻挠绊懀岣咧委煹陌踩院陀行?；在基因功能研究中，高特異性的 TALEN 技術(shù)可以更可靠地敲除或修飾特定基因，為深入探究基因功能提供更有力的工具。?

然而，TALEN 技術(shù)也并非完美無缺。構(gòu)建 TALEN 分子的過程仍然較為耗時，需要進行多步的克隆和組裝操作，這在一定程度上限制了其應(yīng)用的效率。此外，TALEN 技術(shù)的成本相對較高，這也使得其在一些對成本較為敏感的研究和應(yīng)用場景中受到一定的制約。?

1.2.3 CRISPR/Cas 技術(shù)?

CRISPR/Cas 技術(shù)，全稱為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白技術(shù)，是第三代基因編輯技術(shù)，也是目前應(yīng)用最為廣泛和深入的基因編輯技術(shù)之一。該技術(shù)源于細菌和古細菌的免疫系統(tǒng)，是它們抵御外來病毒和噬菌體入侵的重要防御機制。?

CRISPR 序列由一系列短的重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）交替排列組成。當細菌受到病毒或噬菌體的入侵時，病毒的 DNA 片段會被整合到 CRISPR 序列中，成為新的間隔序列。這些間隔序列記錄了病毒的遺傳信息，相當于細菌的 “免疫記憶”。當相同的病毒再次入侵時，CRISPR 序列會轉(zhuǎn)錄生成 pre-crRNA，pre-crRNA 經(jīng)過加工后形成成熟的 crRNA。crRNA 會與 Cas 蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體。在這個復(fù)合體中，crRNA 起到引導(dǎo)作用，它能夠憑借其與目標 DNA 序列互補的部分，引導(dǎo) Cas 蛋白特異性地靶向識別入侵病毒的核酸。?

Cas 蛋白家族具有多種類型，其中最為人們所熟知的是 Cas9 蛋白。Cas9 蛋白含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域：HNH 結(jié)構(gòu)域和 RuvC-like 結(jié)構(gòu)域。當 crRNA 引導(dǎo) Cas9 蛋白識別并結(jié)合到目標 DNA 序列后，HNH 結(jié)構(gòu)域會切割與 crRNA 互補的 DNA 鏈，RuvC-like 結(jié)構(gòu)域則會切割另一條 DNA 鏈，從而在目標位點產(chǎn)生雙鏈斷裂。細胞自身的 DNA 修復(fù)機制會對雙鏈斷裂進行修復(fù)，在修復(fù)過程中，通過引入特定的供體 DNA 模板，可以實現(xiàn)對目標基因的精確編輯，如基因敲除、基因插入或基因替換等操作。?

CRISPR/Cas 技術(shù)具有諸多顯著的優(yōu)勢，使其在基因編輯領(lǐng)域迅速崛起并得到廣泛應(yīng)用。首先，該技術(shù)操作簡便，科研人員只需設(shè)計與目標基因互補的 crRNA 序列，即可引導(dǎo) Cas 蛋白對目標基因進行編輯，相較于 ZFN 和 TALEN 技術(shù)，大大降低了技術(shù)門檻和操作難度。其次，CRISPR/Cas 技術(shù)成本低廉，不需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)設(shè)計和構(gòu)建過程，只需合成相應(yīng)的 RNA 序列，這使得更多的科研團隊和實驗室能夠開展相關(guān)研究。再者，CRISPR/Cas 技術(shù)具有高效性，能夠在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)對目標基因的編輯，并且編輯效率較高，大大提高了研究和應(yīng)用的效率。此外，CRISPR/Cas 技術(shù)還具有廣泛的適用性，不僅可以應(yīng)用于細菌、植物、動物等多種生物體系，還可以用于基因功能研究、基因治療、作物育種、生物制藥等多個領(lǐng)域。?

在基因功能研究方面，CRISPR/Cas 技術(shù)可以快速構(gòu)建基因敲除或敲入的細胞模型和動物模型，幫助科研人員深入了解基因的功能和作用機制；在基因治療領(lǐng)域，CRISPR/Cas 技術(shù)為治療多種遺傳性疾病和疑難病癥帶來了新的希望，例如鐮狀細胞貧血、囊性纖維化等單基因遺傳病，通過對患者體內(nèi)致病基因的編輯，有望實現(xiàn)從根本上治愈疾病；在作物育種中，CRISPR/Cas 技術(shù)可以精準地改良農(nóng)作物的性狀，培育出具有抗病蟲害、耐旱、高產(chǎn)等優(yōu)良特性的新品種，為保障全球糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了有力支持；在生物制藥領(lǐng)域，CRISPR/Cas 技術(shù)可以用于優(yōu)化藥物研發(fā)過程，提高藥物的質(zhì)量和產(chǎn)量，開發(fā)出更高效、更安全的藥物。?

然而，CRISPR/Cas 技術(shù)也存在一些潛在的風險和挑戰(zhàn)。其中最為突出的問題是脫靶效應(yīng)，即 Cas 蛋白可能會在非目標位點進行切割，導(dǎo)致非預(yù)期的基因突變，這可能會對生物體的正常生理功能產(chǎn)生負面影響，甚至引發(fā)新的疾病。此外，CRISPR/Cas 技術(shù)在應(yīng)用過程中還可能引發(fā)倫理道德爭議，例如在人類生殖細胞編輯方面，可能會改變?nèi)祟惖倪z傳基因庫，對人類的遺傳多樣性和未來發(fā)展產(chǎn)生深遠影響，因此需要謹慎對待和嚴格監(jiān)管。?

1.2.4 RNA 編輯技術(shù)?

RNA 編輯技術(shù)是一種新興的基因編輯技術(shù)，與傳統(tǒng)的 DNA 編輯技術(shù)不同，它主要是在 RNA 水平上對遺傳信息進行修飾和調(diào)控，具有可逆性和動態(tài)調(diào)控的特點。RNA 編輯的過程主要涉及一類特殊的酶，其中腺苷酸脫氨酶（ADARs）是最為常見的一類。ADARs 能夠識別 RNA 分子中的特定堿基，通常是腺嘌呤（A），并將其脫氨基轉(zhuǎn)化為肌苷（I）。由于肌苷在 RNA 翻譯過程中會被識別為鳥嘌呤（G），因此這種堿基的改變會導(dǎo)致 RNA 序列與其對應(yīng)的 DNA 序列產(chǎn)生差異，從而實現(xiàn)對基因表達和蛋白質(zhì)功能的調(diào)控。?

RNA 編輯技術(shù)在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。在神經(jīng)系統(tǒng)研究中，RNA 編輯發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，尤其是在腦發(fā)育和功能調(diào)控方面。通過對神經(jīng)元細胞中關(guān)鍵 RNA 分子的編輯，可以模擬或修復(fù)與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，深入研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制，并為開發(fā)針對性的治療方法提供理論依據(jù)。例如，某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能是由于特定 RNA 分子的異常表達或功能缺陷導(dǎo)致的，通過 RNA 編輯技術(shù)對這些 RNA 分子進行精準修飾，有望恢復(fù)其正常功能，從而達到治療疾病的目的。?

在疾病模型研究領(lǐng)域，RNA 編輯技術(shù)為構(gòu)建特定的疾病模型提供了有力工具。科研人員可以通過編輯關(guān)鍵基因的 RNA 序列，模擬疾病相關(guān)突變的效應(yīng)，在細胞或生物體水平上構(gòu)建出與人類疾病相似的模型，用于深入研究疾病的發(fā)生發(fā)展機制、尋找新的治療靶點以及評估藥物的療效和安全性。例如，對于一些復(fù)雜的多基因遺傳病，傳統(tǒng)的研究方法往往難以準確模擬疾病的病理過程，而 RNA 編輯技術(shù)可以在不改變基因組 DNA 的前提下，精準地調(diào)控相關(guān)基因的 RNA 表達和功能，從而更真實地模擬疾病狀態(tài)，為疾病研究提供更有效的模型。?

在藥物研發(fā)方面，RNA 編輯技術(shù)也具有巨大的潛力。通過對 RNA 序列的編輯，可以調(diào)控特定基因的表達水平或功能，為開發(fā)針對特定疾病的治療方法開辟新的途徑。例如，針對某些癌癥，科研人員可以利用 RNA 編輯技術(shù)靶向調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，抑制腫瘤細胞的生長和增殖，或者增強機體的免疫反應(yīng)，提高對腫瘤細胞的殺傷能力；對于一些遺傳性疾病，也可以通過 RNA 編輯技術(shù)修復(fù)突變的 RNA 序列，恢復(fù)正常的基因表達和蛋白質(zhì)功能，從而達到治療疾病的目的。此外，RNA 編輯技術(shù)還可以用于優(yōu)化藥物的作用靶點，提高藥物的特異性和療效，降低藥物的副作用。?

在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，RNA 編輯技術(shù)同樣具有重要的應(yīng)用前景。通過對作物 RNA 序列的編輯，可以改善作物的多種性狀，如提高作物的產(chǎn)量、增強作物對病蟲害的抗性、提升作物的逆境適應(yīng)能力等。例如，通過編輯作物中與光合作用相關(guān)的 RNA 分子，可以提高作物的光合效率，從而增加作物的產(chǎn)量；編輯與作物抗病相關(guān)的 RNA 序列，可以使作物獲得對特定病蟲害的抗性，減少農(nóng)藥的使用，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，同時也有利于環(huán)境保護和生態(tài)平衡。

二、基因編輯技術(shù)行業(yè)發(fā)展歷程?

1、早期探索?

基因編輯技術(shù)的發(fā)展可以追溯到 20 世紀 70 年代，當時正值基因工程的萌芽階段。1970 年，科學(xué)家 Smith H?O 等從流感病毒中成功提取了第一個限制性內(nèi)切酶 Hind II，這一發(fā)現(xiàn)成為基因編輯技術(shù)發(fā)展歷程中的重要里程碑。限制性內(nèi)切酶能夠識別雙鏈 DNA 分子上的特異序列，這些識別區(qū)通常具有回紋結(jié)構(gòu)，并且可以使兩個特定核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，從而實現(xiàn)對 DNA 的切割。這一特性為基因操作提供了關(guān)鍵工具，使得科學(xué)家們能夠在分子層面上對 DNA 進行精確的切割和重組，為后續(xù)基因編輯技術(shù)的發(fā)展奠定了堅實基礎(chǔ)。?

隨著對限制性內(nèi)切酶研究的深入，越來越多的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和鑒定。截至目前，已從微生物中發(fā)現(xiàn)了超過 200 種限制性內(nèi)切酶，其中大部分能夠切割 DNA 形成粘性末端，如 EcoR I，它能夠識別 6 個堿基的特定序列 “5’-G AATTC-3’ ，3’-CTTAA G-5’”，并在識別位點進行切割，形成具有互補堿基的粘性末端，這種粘性末端使得不同來源的 DNA 片段能夠通過堿基互補配對的方式進行連接，為基因重組提供了便利條件。?

在這一時期，科學(xué)家們利用限制性內(nèi)切酶進行了大量的基因操作實驗，包括將外源 DNA 片段與載體連接，構(gòu)建重組 DNA 分子。通過將重組 DNA 分子導(dǎo)入宿主細胞，實現(xiàn)了外源基因在宿主細胞中的表達，開啟了基因工程的新紀元。例如，1973 年，Cohen 和 Boyer 等人成功地將來自不同生物的 DNA 片段連接起來，并將其導(dǎo)入大腸桿菌細胞中，實現(xiàn)了外源基因在大腸桿菌中的表達，這一實驗標志著基因工程技術(shù)的正式誕生，也為基因編輯技術(shù)的發(fā)展提供了重要的實踐經(jīng)驗和技術(shù)支持。?

2、技術(shù)革新階段?

1993 年，CRISPR-Cas 天然免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為基因編輯技術(shù)的發(fā)展帶來了新的契機。當時，科學(xué)家們在對細菌和古菌的研究中，發(fā)現(xiàn)了一種獨特的 DNA 序列，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR），以及與之相關(guān)的蛋白（Cas），它們共同構(gòu)成了 CRISPR-Cas 系統(tǒng)，這一系統(tǒng)被證明是細菌和古菌抵御外來病毒和噬菌體入侵的重要防御機制。然而，在發(fā)現(xiàn)初期，CRISPR-Cas 系統(tǒng)的功能和作用機制并未被完全理解，其在基因編輯領(lǐng)域的潛在應(yīng)用也尚未被充分發(fā)掘。?

進入 21 世紀，隨著對 CRISPR-Cas 系統(tǒng)研究的不斷深入，科學(xué)家們逐漸揭示了其工作原理。2005 年，兩項獨立的研究表明，CRISPR 間隔序列與噬菌體、病毒和質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的序列相似，并且病毒不會感染具有同源間隔序列的細菌，這一發(fā)現(xiàn)揭示了 CRISPR 序列在原核生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的重要作用。2007 年，Danisco 的研究人員通過實驗進一步證實，將源自噬菌體基因組序列的新間隔序列整合到易受噬菌體攻擊的細菌中，能夠改變細菌細胞對噬菌體的抵抗力，從而首次演示了 CRISPR 系統(tǒng)可以作為細菌的一種獲得性免疫機制，防御外來遺傳物質(zhì)的侵入。這些研究成果為 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。與此同時，2000 年左右，RNA 干擾（RNAi）技術(shù)的出現(xiàn)也為基因編輯領(lǐng)域帶來了新的突破。RNAi 是一種由雙鏈 RNA 介導(dǎo)的同源 mRNA 特異性降解的過程，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達進行調(diào)控。1995 年，Guo 等在利用反義技術(shù)研究線蟲的基因功能時，首次觀察到了 RNAi 現(xiàn)象。1998 年，F(xiàn)ire 等將靶向 Par -1 基因的正反義鏈 RNA 混合物注入線蟲卵中，發(fā)現(xiàn)雙鏈 RNA（dsRNA）抑制靶基因表達的能力比任一單鏈 RNA 強 10 倍以上，并且靶 mRNA 受到明顯的干擾，呈現(xiàn)出可傳遞給后代的特異表型，從而正式提出了 “dsRNA 介導(dǎo)的 RNA 干擾” 現(xiàn)象。此后，RNAi 技術(shù)在植物、動物、真菌等多種生物中得到了廣泛證實和深入研究。?

RNAi 技術(shù)的作用機制主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，外源導(dǎo)入或由轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子、病毒感染等方式引入的 dsRNA 被細胞內(nèi)的 Dicer 酶切割成 21 - 23 nt 長的小分子干擾 RNA 片段（siRNA），這些 siRNA 具有 3’末端有兩個堿基凸出，5’末端為磷酸的雙鏈結(jié)構(gòu)。在效應(yīng)階段，雙鏈 siRNA 被包裹進入一個多蛋白復(fù)合體中，形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）。在 ATP 存在的情況下，RISC 被激活，雙鏈 siRNA 打開，其中的單鏈 siRNA 作為向?qū)?，引?dǎo) RISC 尋找與之互補的靶 mRNA，然后內(nèi)切核酸酶在 siRNA 附近切割 mRNA，使其降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達的抑制。?

RNAi 技術(shù)的出現(xiàn)為基因功能研究和基因治療等領(lǐng)域提供了一種強大的工具。通過設(shè)計和合成針對特定基因的 siRNA，可以特異性地沉默目標基因的表達，從而研究該基因的功能和作用機制。在基因治療方面，RNAi 技術(shù)可以用于抑制致病基因的表達，為治療某些遺傳性疾病和病毒性疾病提供了新的策略和方法。例如，在癌癥治療中，通過 RNAi 技術(shù)沉默與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，有望抑制腫瘤細胞的生長和增殖；在抗病毒治療中，針對病毒基因設(shè)計的 siRNA 可以有效抑制病毒的復(fù)制和傳播。?

3、CRISPR-Cas9 技術(shù)的突破?

2012 年，Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 在《Science》雜志上發(fā)表了一篇具有里程碑意義的論文，揭示了 CRISPR-Cas9 基因編輯的詳細作用機制，并指出了其作為基因組編輯工具的巨大潛力。她們的研究發(fā)現(xiàn)，Cas9 蛋白可以利用 RNA 分子作為引導(dǎo)，識別并切割特定的 DNA 序列。在 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中，CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄生成的 pre-crRNA 經(jīng)過加工后形成成熟的 crRNA，crRNA 與反式激活 CRISPR RNA（tracrRNA）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物與 Cas9 蛋白結(jié)合后，能夠引導(dǎo) Cas9 蛋白特異性地靶向目標 DNA 序列。Cas9 蛋白含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域：HNH 結(jié)構(gòu)域和 RuvC-like 結(jié)構(gòu)域，當識別到目標 DNA 序列后，HNH 結(jié)構(gòu)域切割與 crRNA 互補的 DNA 鏈，RuvC-like 結(jié)構(gòu)域切割另一條 DNA 鏈，從而在目標位點產(chǎn)生雙鏈斷裂。這一發(fā)現(xiàn)使得 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)成為一種極具潛力的基因編輯工具，為基因編輯技術(shù)的發(fā)展帶來了革命性的突破。?

2013 年，張鋒在《Science》雜志上發(fā)表論文，首次將 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)改進并成功應(yīng)用于哺乳動物和人類細胞。這一成果使得 CRISPR-Cas9 技術(shù)真正進入了人類基因編輯領(lǐng)域，開啟了基因編輯技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的新篇章。與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)如鋅指核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）相比，CRISPR-Cas9 技術(shù)具有操作簡便、成本低廉、效率高、特異性強等顯著優(yōu)勢?？蒲腥藛T只需設(shè)計與目標基因互補的 crRNA 序列，即可引導(dǎo) Cas9 蛋白對目標基因進行編輯，大大降低了基因編輯的技術(shù)門檻和操作難度。同時，CRISPR-Cas9 技術(shù)的成本相對較低，不需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)設(shè)計和構(gòu)建過程，只需合成相應(yīng)的 RNA 序列，這使得更多的科研團隊和實驗室能夠開展相關(guān)研究。此外，CRISPR-Cas9 技術(shù)的編輯效率較高，能夠在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)對目標基因的編輯，并且可以同時對多個基因進行編輯，為基因功能研究和基因治療等領(lǐng)域提供了更為強大和高效的工具。?

自 2013 年以來，CRISPR-Cas9 技術(shù)在全球范圍內(nèi)得到了廣泛的研究和應(yīng)用，迅速成為基因編輯領(lǐng)域的主流技術(shù)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，CRISPR-Cas9 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、疾病模型構(gòu)建、基因治療等方面。通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建基因敲除或敲入的細胞模型和動物模型，科研人員能夠深入研究基因的功能和作用機制，為揭示疾病的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療方法提供了重要的基礎(chǔ)。在基因治療方面，CRISPR-Cas9 技術(shù)為治療多種遺傳性疾病和疑難病癥帶來了新的希望，如鐮狀細胞貧血、囊性纖維化等單基因遺傳病，以及癌癥、艾滋病等復(fù)雜疾病。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，CRISPR-Cas9 技術(shù)被用于改良農(nóng)作物的性狀，培育具有抗病蟲害、耐旱、高產(chǎn)等優(yōu)良特性的新品種，為保障全球糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出了重要貢獻。在生物制藥領(lǐng)域，CRISPR-Cas9 技術(shù)加速了創(chuàng)新藥物的研發(fā)進程，為開發(fā)新型治療方法和藥物提供了廣闊的空間。

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